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诊断试剂评价系列6-核酸提取试剂

诊断试剂评价的核心是标准,每个实验室的评价都要遵循相同的评价标准,使用相同的评价指标,这样的试剂评价才是有意义的。如果大家都各说各话,试剂评价也就失去了意义。核酸检测中最重要的当然是扩增试剂,这也是目前大家最关心的。其实提取试剂的重要性丝毫不逊于扩增试剂,但是提取试剂的往往被忽略,有时甚至沦为赠品,客户也不愿花更多的钱买更好的提取试剂。一方面是提取试剂的成熟度比较高,大品牌的产品性能差异比较小,另一方面缺乏系统的评价标准,用户无从下手无法辨别提取实际的好坏也是一个重要因素。本章内容将结合GB/T 37875-2019 《核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范》和我在日常检测中的经验让你从此对核酸提取试剂的评价不再迷茫。


一、常用的核酸提取类型

1.酚/氯仿抽提法

苯酚和氯仿均为有机溶剂,对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用,但对核酸本身没有影响。经离心后,形成上层水相下层酚/氯仿相,变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层,而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相;同时,氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后,再将核酸通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。

优点:效率高,通常比离心柱的产量高、适用于提取完整的高分子量DNA。

缺点:含有微量的苯酚和氯仿会对后续PCR反应产生影响、费时费力、使用有毒溶剂。


2、离心柱法

首先利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上,这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力,对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附,因而在离心时与核酸分离。最后用洗脱液洗将吸附在特异载体上的核酸脱下来,分离得到纯化的核酸。适合少量样品的核酸提取。

优点:成本低、方法可靠。

缺点:结合能力有限、容易堵塞,无法实现高通量自动化检测。



 (图片来网络,版权归原作者所有)

3、磁珠法

运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。带负电荷的核酸与低pH下带正电荷的磁珠结合,在高pH下释放,磁珠通过磁铁去除,从而核酸就从各类样本中分离出来。

优点:提取效率高、可实现高通量、自动化。

缺点:试剂和提取仪成本较高。



 (图片来网络,版权归原作者所有)


二、核酸提取试剂的评价

本部分内容主要结合GB/T 37875-2019 《核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范》,我只挑干货讲解,详细内容大家自行查阅标准。

核酸提取方法评价总则:

核酸提取纯化试剂盒的质量评价,应使用与试剂盒声称适用的样品一致或接近的标准物质(包括日常用于评估测量程序精密度的标准物质/标准样品,即质量控制样品)。当没有标准物质时,可使用足够均匀的、与试剂盒声称适用的样品一致或接近的样品。应使用经计量检定或校准的仪器。


1.产量:

评价指标:核酸提取纯化试剂盒从一定质量或体积的样本中提取得到的DNA或RNA的总质量 。

评价方法:

1.1紫外分光光度法:详见2.1

1.2荧光法:采用荧光计测量,荧光染料标记核酸的荧光强度与核酸含量成正比。此方法可以排除核糖核酸、脱氧核糖核酸以及蛋白质三者之间的相互干扰。为保证结果的准确性,标准曲线上的每个浓度应做2个平行。每个样品应重复检测三次,从与荧光染料的混合开始。




2. 纯度:

评价指标:以核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对比值以核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对比值(如 OD260/OD280和 OD260/OD230)或电泳图条带等表示核酸提取产物的纯度。 

评价方法:

2.1紫外分光光度法 :理论上核酸在260nm处达到最大的吸收峰,蛋白质在280nm 处达到最大的吸收峰,多糖和有机溶剂在230nm处达到最大的吸收峰。用紫外分光光度计测定260nm、280nm、230nm下提取液的吸光度 OD260、OD280、OD230,计算 OD260/OD280和OD260/OD230,判断提取产物的纯度。每个样品重复测定3次,计算求得平均比值。



2.2琼脂糖凝胶平板电泳法: 采用琼脂糖凝胶平板电泳法检测非目标核酸残留的电泳条带。



3.完整度:

评价指标:提取核酸时,防止物理因素(剪切力、高温)、化学因素(强酸、强碱)和生物因素(核酸酶)破坏,保持核酸一级结构完整而不发生改变的程度。 

评价方法:

采用琼脂糖凝胶平板电泳法、芯片电泳法等方法进行核酸完整度的测定。分析不同相对分子质量大小核酸片段的荧光亮度或峰高,评估提取核酸的完整度。


4.重复性 :

评价指标:重复性条件下,核酸提取产量、纯度和完整度的精密度。 

评价方法:在同一实验室,由同一操作员使用相同的设备,采用同一批次的提取纯化试剂盒,对标准物质或足够均匀的样品,进行提取纯化。在1d内重复提取不少于6个平行样品


5.再现性:

评价指标:再现性条件下,核酸提取产量、纯度和完整度的精密度。

评价方法:在不少于5家不同的实验室,由不同的操作员使用不同的设备,采用同一批次的核酸提取纯化试剂盒,对同一标准物质或足够均匀的样品,进行提取纯化。各重复提取3个平行样品。


6.批间差异:

评价指标:重复性条件下,同一厂家试剂盒,不同批次间的核酸提取产量、纯度和完整度的精密度。

评价方法:在同一实验室,由同一操作员,使用相同的设备,采用同一核酸提取纯化试剂盒的3个不同批次,对同一标准物质或足够均匀的样品,进行提取纯化。各批次试剂盒分别重复提取3个平行样品


7.细菌内毒素残留:

评价指标:核酸提取物中残留的来源于革兰氏阴性菌细胞壁的细菌内毒素脂多糖的含量。

评价方法:对于提取用于转染的质粒或其他用于生物体内试验的核酸试剂盒,对提取核酸中的细菌内毒素残留进行定量。测定方法参考《中华人民共和国药典》(2015年版)四部的“1143细菌内毒素检查法”中的方法2“光度测定法”

8.小结
8.1用于核酸提取试剂盒评价的样品:“使用与试剂盒声称适用的样品一致或接近的标准物质包括质量控制样品。当没有标准物质时,可使用足够均匀的、与试剂盒声称适用的样品一致或接近的样品。”

8.2产量虽然推荐使用紫外分光光度法和荧光法,但是荧光法测得的结果更加准确。

8.3 对于样品中病毒的核酸提取,产量、纯度和完整度的评价指标只能提供总核酸信息,无法提供病毒核酸的信息 。

8.4对于单一检测实验室只需要评价重复性指标和批间差异指标,无需评价再现性。

8.5只有有特定要求的情况下才有必须要进行细菌内毒素残留评价。


三、核酸提取试剂评价的试验设计

1.比对样品的选择

1.1标准化的样品:首选标准物质、其次质控品、再次均匀稳定的病毒(活疫苗或全病毒灭活苗),临床组织样品由于无法做到均匀和稳定不建议使用。该类样品可以用来评估提取试剂盒的批内重复性和批间重复性。

1.2基质样品:感染的各种类型的组织或者阴性组织使用1.1的样品做基质添加实验,用来评估提取试剂对不同基质的提取效果。根据笔者日常的经验,基质比较粘稠的抗凝血、精液和某些食品等类型的样品对提取效率有较大的影响。


2.检测方法

2.1特异性核酸检测方法:使用荧光定量PCR和数字PCR的半定量或定量的方法特异性检测病原含量。由于核酸含量差一倍在荧光定量PCR检测的表现Ct值仅仅差1。对于提取试剂的差异小于1倍时,使用数字PCR进行评价更加精确。

2.2荧光法:测定提取总核酸的产量。

2.3紫外分光光度法:测定提取总核酸的纯度。

2.4电泳法:测定提取总核酸的片段大小分布。


3.核酸提取试剂评价

3.1重复性试验:

最低要求:使用标准物质或质控品进行6次重复,Ct值变异系数应小于5%。

推荐:至少3份样品分别是中浓度样品(Ct25-30),低浓度样品(Ct30-35)和阴性样品,每个样品6次重复,Ct值变异系数应小于5%。



3.2线性试验

将标准物质或质控品做10倍倍比稀释,每个浓度至少重复3次。计算R^2>0.99



图片来自天隆科技资料

3.3基质干扰试验

使用各种感染组织或将标准物质或者质控品添加至各类阴性基质以评估提取试剂对各类基质的提取效果。在不具备样品的情况下也可使用血红蛋白、胆红素和甘油三脂等干扰物进行模拟。



引自董浩等.6种核酸提取试剂盒的布鲁氏菌核酸提取效率比较[J].中国动物检疫,2020,37(06):81-85.


3.4最低检测限评估

在试剂盒临界值附近做20次重复,19次以上(95%概率)检出为阳性。


3.5准确度试验

当有有证标准物质时,由于标准物质带有精确的量值和不确定度,因此可以通过标准物质准确的评估提取试剂的提取效果。与标准物质量值的绝对偏差应不超过±0.5对数数量级。



3.6提取气溶胶污染的评估

对于自动化的核酸提取仪,在提取过程中是否会发生核酸气溶胶污染也是我们需要关注的问题。可以使用阴性样品和阳性样品交替摆放一同提取的方式来评估提取过程中是否产生气溶胶污染。提取后所有阴性样品未被污染为合格。

3.7使用体验评估

包括操作便利性、总提取时间、上样量、是否预分装等操作评价。


总结:目前无论是针对非洲猪瘟病毒还是新型冠状病毒进行核酸检测,检测的要求已经达到1拷贝/微升的量级,这就要求我们检测中的每一个环节都达到最优,因此科学系统的评估核酸提取试剂势在必行!